У нас уже 21989 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Разработка Биотекнологическик процессов получения Биологически активный соединений из медоносный пчел и исследование ик свойств
Количество страниц 150
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 25148.doc 
Содержание Введение...4

1. Обзор литературы...9

1.1. Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства...9

1.2. Области применения...12

1.3. Основные источники хитина и хитозана...14

1.3.1. Ракообразные {Crustacea)...14

1.3.2. Грибы {Fungi)...17

1.3.3. Насекомые {Insectd)...19

1.3.4. Нетрадиционные источники...25

1.4. Способы переработки хитинсодержащего панциря ракообразных...26

1.4.1. Получение хитина с помощью химических и биотехнологических способов обработки...26

1.4.2. Получение хитозана с использованием химических и ферментативных методов...30

1.4.3. Способы гидролиза хитозана...35

1.5. Получение хитина и хитозана из насекомых...46

2. Экспериментальная часть...'...51

2.1. Объекты исследований, исходные материалы и

химические реагенты...51

2.2. Методы исследования...52

2.2.1. Технологические стадии...52

2.2.2. Методы анализа...55

2.2.3. Изучение некоторых свойств полученных веществ...59

3 .Результаты и их обсуждение...62

3.1. Разработка технологии получения биологически активных веществ из

подмора пчел...62

3.1.1. Водная экстракция...63

3.1.2. Депротеинирование...67

3.1.3. Обесцвечивание...72

3.1.4. Деацетилирование...80

3.1.5. Ферментативный гидролиз...86

3.2. Технология переработки подмора пчел...99

3.3. Физико-химические свойства полученных продуктов...103

3.4. Биологические свойства полученных продуктов...114

3.4.1. Антиоксидантные свойства...114

3.4.2. Генопротекторные свойства...122

3.4.3. Фотопротекторные свойства...127

4. Выводы...133

Список литературы...134

Приложение...150

Введение



4 ВВЕДЕНИЕ

Полисахариды хитин и хитозан, а также их производные, считаются, перспективными биоматериалами будущего. По некоторым оценкам, предполагаемый объем производства изделий из этих биополимеров в 2005г. составит около 2 млрд. долларов, из которых — 75% будет использовано в пищевой, косметической и фармацевтической промышленностях, биотехнологии, сельском хозяйстве. Уникальная структура макромолекулы хитозана и наличие положительного заряда обусловливают проявление ряда полезных свойств (антиоксидантные, радиопротекторные, волокно- и пленкообразующие, иммуномодулирующие, противоопухолевые и др.), а также его низкую токсичность и способность к биодеградации.

Пигмент меланин представляет собой высокомолекулярный биополимер нерегулярной структуры, относящийся к классу конденсированных фенольных соединений, обусловливающих темную окраску покрова насекомых, волос человека, клеточной стенки грибов, растений и микроорганизмов. Наличие разнообразных функциональных групп, высокостабильных парамагнитных центров, сопряженной системы двойных связей в молекуле меланина обеспечивают разнообразное применение в качестве фото-, радиопротекторов и антиоксидантов в различных областях промышленности.

На сегодняшний день основным источником для получения хитина и хитозана являются панцири ракообразных (крабы, креветки, криль). Технология обработки включает постадийное удаление сопутствующих веществ с использованием химических и ферментативных способов обработки. Основными субстратами для выделения меланинов являются чернильная сумка каракатицы Sepia offlcinalis, микро- и макромицеты, грибы и дрожжи, темные сорта винограда, проявляющие сходные биозащитные свойства с меланинами животного происхождения.

Расширение областей применения; данных биополимеров обусловливает поиск новых перспективных источников хитина и меланина. Как известно, в покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету. Вместе с хитином и белком в кутикуле присутствуют эумеланины, ковалентно связанные с остальными компонентами, обусловливающие окраску насекомого и некоторые защитные свойства. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ с возможностью выделения в отдельном виде или в виде комплексов. Благодаря традиционно развитому пчеловодству в нашей стране в качестве источника биологически активных веществ можно предложить подмор пчел - медоносные пчелы Apis mellifera L., погибшие во время зимовки в улье. Согласно расчетам, сырьевая база подмора пчел может составить от 6 до 10 тыс. тонн в год.

Цель настоящей работы - разработка биотехнологических процессов получения хитина, хитозана, меланина и их комплексов из подмора пчел, изучение некоторых физико-химических и биологических свойств данных полимеров.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи исследования:

¦ разработать технологию переработки подмора пчел с учетом особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии обработки;

¦ согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить= комплексную переработку подмора пчел с получением интересующих биологически активных веществ;

¦ изучить основные физико-химические свойства промежуточных и основных продуктов, полученных на каждой стадии переработки;

¦¦¦' исследовать некоторые биологические свойства водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозан-меланинового комплекса.

Научная новизна работы

Обосновано использование кутикулы пчелиных для получения различных соединений. Разработана комплексная технологическая схема переработки пчелиного подмора с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и низкомолекулярныи хитозан-меланиновый комплекс. Определены основные оптимальные параметры переработки пчелиного подмора на каждой стадии обработки. Учитывая особенность сырья, обоснована необходимость включения стадии обесцвечивания в технологию переработки с целью более полного удаления пигмента. При исследовании ферментативного гидролиза показано, что хитозан-меланиновый комплекс может гидролизоваться с использованием специфических и неспецифических ферментов. Показано, что, варьируя условиями ферментативного гидролиза, существует возможность получения; хитозан-меланинового комплекса с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования в зависимости от целей использования. Исследованы антиоксидантные, генопротекторные и фотопротекторные свойства хитозан-меланинового комплекса и меланинсодержащих продуктов из подмора пчел.

Впервые показана возможность использования кутикулы пчелы Apis mellifera L. для одновременного выделения меланиновых пигментов и комплекса хитозана с меланином с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования.

Практическая значимость работы

Разработана комплексная схема переработки подмора пчел с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и хитозан-меланиновый комплекс. Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии. Разработана рецептура косметического крема на основе водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозана для обеспечения фотозащитных свойств.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 25 рисунков, библиографию из 158 наименований.

Список сокращений:

ДМ - деминерализация

ДП - депротеинирование

ДА - деацетилирование

ММ - молекулярная масса полимера

Mv - средневязкостная молекулярная масса полимера

Mw - средневесовая молекулярная масса полимера

Мп - среднечисловая молекулярная масса полимера

СА - степень ацетилирования

СДА - степень дезацетилирования

ХМК — хитин-меланиновый комплекс

ХзМК - хитозан меланиновый комплекс

БМК — белок-меланиновый комплекс

ВМХ — высокомолекулярный хитозан

НМХ — низкомолекулярный хитозан

АГА - N-ацетилглюкозоамин

ГА - глюкозоамин

ФСС — фермент-субстратное соотношение

УФ - ультрафиолет

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ДИСК - динитросалициловая кислота

ТГ - термогравиометрия

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

КЧ - кислотное число

40 - число омыления

ПЧ - перекисное число

V

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства

Хитин (поли К-ацетил-Б-глюкозоамин)-

со

N

азотосодержащии линейный полисахарид, по

^ _ ^ я2ону

химическому строению и структурным характеристикам сходен с целлюлозой, занимает второе место после нее по распространенности в природе

сн2он га

6о сн,

п

(рис.1). Ежегодно в биосфере образуется и

Рис.1. Структура хитина утилизируется около 10 гигатонн (10 кг) хитина.

Хитин встречается в наружном покрове членистоногих (ракообразные, насекомые), скелете морского зоопланктона, клеточной стенке грибов и дрожжей, трубках погонофор [1]. Хитин также присутствует в стенках цисты инфузории, клетках зеленых водорослей,, иглах диатомовых, стеблях золотистых и волокнах гаптофитовых водорослей [2]. Хитин отсутствует у прокариотных организмов и у растений, хотя в состав клеточной стенки бактерий входит муреин, содержащий К-ацетил-Б-глюкозоамин. В живых организмах хитин образует микрофибриллярный порядок, что обеспечивает линейную конформацию молекул, закрепленную водородными связями. Эти фибриллы диаметром от 2,5 до 2,8 нм обычно входят в белковую матрицу [3].

Хитин присутствует в трех полиморфных модификациях с различной ориентацией хитиновых микрофибрилл: а, р, у. Наиболее распространена а-форма, в которой цепи полимера антипараллельны и плотно упакованы. Она присутствует в панцире ракообразных и моллюсков, кутикуле насекомых, клеточной стенке грибов. В /?-форме цепочки параллельны и обладают более высокой растворимостью и набуханием за счет более слабых межмолекулярных водородных связей [4]. Эта форма встречается у

10

каракатицы, в гладиусе кальмара, внеклеточной сердцевине диатомей, трубках погонофор, у—Форма имеет смешанную систему параллельных и антипараллельных цепочек и присутствует в коконах насекомых [5]. /?— и у-Формы хитина переходят в а-форму под действием концентрированных кислот (муравьиной, азотной и соляной), которая является наиболее стабильной. Все три формы хитина могут встречаться и у одного организма, например, кальмара Loligo [6]. Это говорит о том, что различные формы хитина выполняют в организме разнообразные функции.

Хитин нерастворим в воде, разбавленных кислотах, щелочах, спиртах и наиболее часто используемых органических растворителях, устойчив к действию многих химических реагентов. Он растворим в концентрированных растворах соляной, серной и муравьиной кислот, а также в некоторых солевых растворах при нагревании. В смеси диметилацетамида, №метил-2-пирролидона и хлористого лития, а также в гексафторпропаноле, гексафторацетоне вместе с водными растворами минеральных кислот хитин растворяется без разрушения полимерной структуры [3]. В растворах некоторых солей (например, тиоцианата лития) хитин переходит в коллоидный раствор. Он способен образовывать комплексы с органическими (холестерин, белки, пептиды) веществами, обладает высокой сорбционной способностью к тяжелым металлам, радионуклидам. Хитин не разлагается под действием ферментов млекопитающих, но разлагается некоторыми ферментами насекомых, грибов и бактерий, отвечающих за распад хитина в природе. В среднем молекулярный вес природного хитина составляет 106Да и более [7]. Среди разнообразных производных этого полимера наиболее доступным является хитозан, который получают в процессе деацетилирования хитина.

СН2ОН NH

2

11

Хитозан (поли-Д-глюкозоамин) в отличие от хитина в живых организмах не встречается, за исключением некоторых 2

видов грибов (рис. 2).

Рис.2. Структура хитозана

Важной характеристикой полимера

является степень ацетилирования: отношение остатков N-ацетил-Д-глюкозоамина к общему количеству мономерных звеньев в полимере. Общепринято считать, что хитозан — это полимер со степенью ацетилирования ниже 50%. Степень ацетилирования влияет на свойства полимера и определяет растворимость в разбавленных растворах кислот (2<рН<6) [8]. Хитозан растворим в разбавленных неорганических кислотах (соляной, азотной) и органических (муравьиной, уксусной, янтарной, молочной, яблочной), нерастворим в лимонной и винной кислотах [9]: Аминогруппы! молекулы хитозана имеют константу ионной диссоциации (рКа) 6,3-6,5 [10]. Ниже этого значения аминогруппы протонированы и хитозан представляет собой катионный полиэлектролит, хорошо растворимый в воде. Выше — аминогруппы депротонированы и полимер не растворяется в водных растворах. Такая зависимость растворимости от рН позволяет получать хитозан в различных формах (капсулы, пленки, мембраны, гели, волокна и др.):

Растворимость хитозана в слабокислых водных растворах существенно повышается при понижении молекулярной массы и повышении степени деацетилирования. Высокомолекулярный хитозан со степенью деацетилирования 70-80% плохо растворяется; в водных растворах (рН 6,0-7,0), что существенно ограничивает возможности его практического применения.

Хитозан за счет высокого положительного заряда имеет большое сродство к сорбции таких молекул, как белки, пестициды, красители, липиды, хелатированию ионов переходных металлов (Cu2+, Ni2+,Zn2+, Cd2+, Hg2+, Pb2+, Cr3+, VO2+, UO22+) и радионуклидов [11]. Хитозан и его

12

производные обладают антибактериальными, иммуностимулирующими, противоопухолевыми, ранозаживляющими и другими свойствами.

1.2. Области применения

Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно интенсифицировались исследования по изучению этих природных полимеров. На сегодняшний день известно более 200 областей применения данных биополимеров.

Пищевая промышленность

•/ в качестве эмульгатора простых и многокомпонентных эмульсий; загустителя соусов, приправ, паштетов, паст, жидкой панировки; для фракционирования молочного сырья, стабилизации гомогенных и гетерогенных систем при производстве пудингов, муссов, желе;

•S для осветления жидкости в производстве вин, пива, соков, молочной; сыворотке, промывных вод пищевого производства [12];

S для образования защитных пленок на поверхности плодов и овощей;

•S консервант с целью подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры и повышения биологической ценности продуктов питания и напитков, самостоятельно или в сочетании с консервантами [13];

S в качестве биологически активных добавок для связывания! и выведения из организма жиров, избыточного холестерина [14].

Парфюмерно-косметическая промышленность S в составе косметических кремов для образования защитной пленки на

коже, снижающей потерю воды, и повышения* эффективности УФ-

фильтров [3]; S в средствах по уходу за волосами (шампуни, бальзамы, лосьоны) для

улучшения расчесываемое™, уменьшения статического заряда,

предупреждения перхоти и увеличения блеска волос;

13

в качестве гелеобразователя в жидком мыле, гелевых зубных пастах (0,5-1,5%), лаках для ногтей с бактерицидными свойствами [15]; в парфюмерии в качестве стабилизатора аромата духов [16].

Медицина

в виде порошков, мазей, гелей, присыпок, повязок, губок, искусственной кожи для лечения ран, обеспечивая механическую защиту раны, стимулируя процессы регенерации поврежденной ткани; для приготовления шовного материала, ускоряющего заживление ран в 3-4 раза [17];

для фиксации переломов, репарации дефектов и регенерации костной ткани; лечения и устранения дефектов, поражений и ожогов слизистой оболочки полости рта и зубов [18];

как функциональный материал в виде основы для создания мембран, обладающих адгезивными свойствами, пленок, наночастиц и наносистем для доставки витаминов, белков, пептидов и лекарственных средств различными методами (перорально, назально, парентерально) и пролонгации их действия [19, 20];

в качестве радиопротектора при острой лучевой болезни [21];

в виде сульфата хитозана как аналог гепарина, обладающий антикоагулянтной активностью: замедляющий свертывание крови и препятствующий возникновению тромбов [22].

Сельское хозяйство

для облагораживания почв в композициях с природными или искусственными удобрениями;

в качестве связующего материала при изготовлении гранулированных форм удобрений [23];

14

S как эффективный элиситор, вызывающий системную и продолжительную болезнеусточивость у растений против различных заболеваний (бактериальных, грибных, вирусных, нематод) при обработке семян до посева и обработке растений в фазу ветвления;

•S в качестве ростостимулирующего средства сельскохозяйственных растений [24].

Экология (

S для очистки сточных вод от тяжелых металлов, радионуклидов, белков, углеводородов, пестицидов, красителей и бактериальных клеток [25].

1.3. Основные источники хитина и хитозана

1.3.1. Ракообразные (Crustacea)

В настоящее время основными источниками для получения хитина и хитозана являются членистоногие, а именно ракообразные. Одним из наиболее популярных источников сырья в промышленном масштабе остаются отходы от переработки морских панцирьсодержащих гидробионтов: крабы, креветки, лобстеры и др. Главной особенностью такого сырья является отсутствие затрат на его разведение и выращивание. Первые затраты возникают с началом добычи. Согласно опубликованным в 2000г. данным Международной продовольственной организации ФАО, промыслом морских гидробионтов занимаются всего 133 страны. Группа стран-лидеров, на которую приходится более половины мировой добычи, представлена двумя странами - Китай и США. Россия находится на 13 месте по производству панцирьсодержащих гидробионтов. К настоящему времени уровень ежегодного мирового производства хитина оценивается в 3700 т, а хитозана - 2000 т. Из них на долю отечественного производства приходится 80 тонн в год [26].

15

Хитин в панцире ракообразных присутствует в а-форме и образует нанофибриллы диаметром 3 нм, содержащие по 19 молекулярных цепочек длиной около 0,3 мкм [27]. В панцире хитин образует комплексы с белками (до 50%), взаимодействуя с аспарагиновой кислотой и/или остатками гистидина, минералами (аморфные карбонаты и фосфаты кальция) и пигментами (лютеин, р-каротин, астаксантин), придающими механическую прочностью и упругость [28,6]. В России основными источниками хитинсодержащего сырья являются:

> Крабы

Крабодобывающие предприятия Дальнего Востока в качестве сырья для производства хитина и хитозана заготавливают панцирь головогруди и конечностей следующих видов крабов: камчатского краба {Paralithodes camtschaticus), синего краба (Paralithodes platypus), равношипого (Lithodes aequispina), крабов-стригунов опилио (Chionoecetes opilid) и бэрди (Chionoecetes bairdi). Природный хитин крабов не бывает полностью ацетилированным и часто содержит 82,5% ацетилглюкозоамина, 12,4% глюкозоамина и 5% воды [29]. Химический состав панциря крабов и других; ракообразных представлен в таблице 1.

> Гаммарус

Одним из наиболее массовых и легко добываемых объектов является рачок-бокоплав Gammarus (Rivulogammarus) lacustris Sars, обитатель Балтийского моря, озер и рек, Куршского и Вислинского заливов Калининградской области, широко распространенный в озерах Западной Сибири и Челябинской области. Его запасы исчисляются тысячами тонн, а вылов не сопряжен с нарушением биологического равновесия в водоемах. Относительно высокое содержание хитина (25-30%) и малая толщина панциря (100-500 мкм) облегчают процесс его переработки для получения

16

хитина и хитозана [30]. Химический состав гаммаруса представлен в таблице 1.

> Криль (креветки)

Одним из перспективных источников для России может служить антарктический криль {Euphausia superba Dana), массовые скопления которого находятся в Атлантическом, Тихоокеанском и Индоокеанском секторах Антарктики. По некоторым оценкам его запасы составляют 50 млн. т, а выход хитина после обработки криля-сырца — около 1%. Сегодня мировой вылов криля оценивается в 100 тыс. т. Таким образом, можно увеличить мировой вылов морских панцирьсодержащих за счет криля на 36-40%. В настоящее время сырьевая база криля могла бы обеспечить почти круглогодичный промысел [31]. Состав антарктического криля представлен в таблице 1.

Таблица 1

Химический состав морских и пресноводных ракообразных [29,31]

Вид сырья Влага, % Содержание, % на сухое вещество

Общий азот Липиды Минеральные вещества Хитин

Панцирь краба 9,7 5,9 0,9 33,8 32,4

Панцирь креветки 9,8 6,7 13,9 24,8 9,7

Панцирь речного рака 8,0 5,8 9,0 42,0 35,0

Гаммарус сушеный мороженый 10,0 77,2 8,7 9,04 7,7 14,1 26,1 20,9 6,6 6,2

Антарктический криль 73-77 до 45 2,0-3,2 2,6-3,0 2,8-4,5

Гладиус кальмара - - 2-5 0,5-2 28-35

Панцири ракообразных довольно дорогостоящее сырье, цена которого зависит от сезонности, связана с возрастом и биологическим видом. В последнее время особенно важным фактором стала загрязненность панцирей тяжелыми металлами, ядохимикатами и другими ядовитыми отходами ряда

17

производств. Кроме того, получение хитина из ракообразных может быть рентабельным только при условии одновременного извлечения всех полезных веществ, которые содержатся в панцире. Поэтому существует необходимость, поиска новых сырьевых источников. В этом отношении особого внимания заслуживают такие хитинсодержащие организмы, как мицелиальные грибы, водоросли, насекомые. Получение из указанных источников полиаминосахаридов заслуживает особого внимания в связи с необычными физико-химическими свойствами, хитина и хитозана, а также возможностью использования экологичных многоцелевых биотехнологий.

1.3.2. Грибы (Fungi) i

Клеточная: стенка почти всех грибов^ за исключением Acrasiales, содержит хитин. Содержание хитина у грибов подвержено значительным колебаниям в зависимости от условий культивирования и систематического положения • организма и; составляет от 0,2 до ¦• 26%. К примеру, содержание хитина на грамм сухой биомассы у Aspergillaceae составляет 20—22%, У РетсИИиш'- 4-5j5%. У высших грибов содержание хитина от 3 до! 5%, у плодового тела белого гриба— 6,7%. Содержание хитина неодинаково даже у грибов, относящихся к одному роду. Например, у семейства Aspergillaceae вид A. flavus содержит до 22% хитина, А\ niger — 7,2%, а А. parasiticus — 15,7%. Количество хитина у некоторых грибов >¦ довольно значительно меняется и в пределах вида, например, у разных штаммов A.niger от 11,7 до 24%; В пекарских дрожжах глюкозамин был найден еще в 1915 г. Установлено, что этот полисахарид присутствует у 29 видов дрожжей, кроме Schizosaccharomyces [32]. Хитин в дрожжах присутствует в а-форме в» количестве 1—3% и имеет среднюю молекулярную массу около 25 кДа [33].

Клеточная стенка грибов представляет собой систему микрофибрилл, встроенных в аморфный матрикс. Такие фибриллы или скелетные компоненты могут быть, построены из целлюлозы, глюкана и хитина! в: зависимости от видовой принадлежности грибов. Остальные полисахариды,

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 25148.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2024. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.