Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Влияние поверхностно—активный веществ и полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы D

У нас уже 21989 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Влияние поверхностно—активный веществ и полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы D

Количество страниц	96

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	24760.doc

Содержание	Содержание Список сокращений 4 Введение 5 Глава 1. Литературный обзор 9 1.1. Амфифилы и их классификация 9 1.1.1. Характеристика синтетических поверхностно-активных 10 веществ 1.1.2. Распространение, структура и функция фосфолипидов 14 1.1.3. Агрегатное состояние фосфолипидов в водном растворе 16 1.1.4. Воздействие поверхностно-активных веществ на 19 агрегатное состояние фосфатидилхолина в растворе 1.2. Типы фосфолипаз 22 1.2.1. Распространение, локализация и функции фосфолипазы 27 D 1.2.2. Методы выделения и очистки фосфолипазы D 29 1.2.3. Молекулярные характеристики фосфолипазы D 33 1.2.4. Гидролитическая активность фосфолипазы D 35 1.2.5. Трансферазная активность 39 1.2.6. Кинетика и механизм реакций 40 1.3. Взаимодействие поверхностно-активных веществ с 43 белками 1.4. Взаимодействие полисахаридов с белками 44 Глава 2. Материалы и методики эксперимента 51 2.1.1. Материалы 51 2.1.2. Выделение фосфолипазы D 54 2.2. Методы исследований 55 2.2.1. Приготовление липидных везикул 55 2.2.2. Определение гидролитической активности 55 2.2.3. Определение холина рейнекатным методом 56 3 2.2.4. Определение содержания белка в препаратах 56 фосфолипазы D 2.2.5. Съемка УФ-спектров растворов 54 2.2.6. Измерение мутности растворов 57 2.2.7. Потенциометрические измерения растворов 57 2.2.8. Реологические измерения растворов 58 Глава 3. Влияние поверхностно-активных веществ на 59 ферментативную активность фосфолипазы D 3.1 Характеристики препаратов фосфолипазы D 59 3.2. Влияние поверхностно-активных веществ на активность 62 фосфолипазы D 3.3. Действие солей кальция на ферментативную активность 67 фосфолипазы D 3.4. Влияние соосаждения фосфолипазы D кальциевыми 70 солями анионных поверхностно-активных веществ на ее активность 3.5. Механизм воздействия анионных поверхностно- 74 активных веществ на фосфолипазу D Глава 4. Влияние полисахаридов на ферментативную 83 активность фосфолипазы D Заключение 92 Выводы 94 Список литературы 96 Введение Список сокращений ККМ - критическая концентрация мицеллообразования ФЛ - фосфолипид ФХ - фосфатидилхолин ФК - фосфатидная кислота ФЭ - фосфатидилэтаноламин ФС - фосфатидилсерин ФГ — фосфатидилглицерин ФИ - фосфатидилинозитол ДФГ - дифосфатидилглицерин СМ - сфингомиелин ПАВ - поверхностно - активные вещества ДДС - додецилсульфат натрия ДДОС - додецилдиоксиэтиленсульфат натрия ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид КАЭФ - керамидаминоэтилфосфонат ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ММ - молекулярная масса БСА - бычий сывороточный альбумин ГОЭЦ - гидроксиэтилцеллюлоза Кат-ГОЭЦ - катионный заместитель гидроксиэтилцеллюлозы Кат-ГФГОЭЦ и ГФ-кат-ГОЭЦ - гидрофобно модифицированные производные ГОЭЦ Введение Актуальность работы. Фосфолипаза D (фосфатидилхолин фосфатидогидролаза ЕС 3.1.4.4) относится к группе важных ферментов, которые в живых системах выполняют разнообразные функции от усвоения питательных веществ до синтеза биологически активных соединений. Фосфолипаза D проявляет прежде всего гидролитическую активность, в результате которой происходит расщепление сложноэфирной связи между остатком фосфатидной кислоты и спирта в молекулах фосфолипидов (ФЛ). При этом последний замещается на водород, но возможен перенос остатка фосфатидной кислоты на самые разные гидроксилсодержащие акцепторы, что представляет большой интерес для биотехнологии, так как трансфосфатидилирующая активность фосфолипазы D, как показано в работах Виджика и Аурича с соавт. (Wijk et al, 1992; Aurich et al, 1997; Aurich et al, 2002), может быть использована для синтеза разнообразных лекарственных препаратов. К особенностям фосфолипаз и фосфолипазы D, в частности, относятся условия их функционирования. Поскольку субстрат сосредоточен в биологических мембранах или мембранных органеллах, они проявляют наибольшую активность на границе раздела фаз. Когда ФЛ находятся в растворе в виде мономеров, ферментативная активность оказывается на минимальном уровне, но резко возрастает после перевода ФЛ в агрегированное состояние (Wilton, Waite, 2002). Другим важным фактором, регулирующим активность фосфолипазы D в растворе, является наличие поверхностно-активных веществ (ПАВ). Введение анионных ПАВ в состав реакционной смеси практикуется с первых работ после обнаружения фермента (Dawson, Hemington, 1967; Quarles, Dawson, 1969), поскольку в их присутствии увеличивается как скорость, так и степень гидролиза ФЛ. Между тем, механизм воздействия ПАВ на фосфолипазу D до настоящего 6 времени не установлен. Понимание особенностей функционирования фосфолипазы D в средах с агрегированным субстратом и роли ПАВ представляет значительный интерес как для фундаментальной, так и прикладной науки, поскольку касается ее эффективного использования в биотехнологии. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении механизма воздействия ПАВ на активность фосфолипазы D и роли агрегатного состояния субстрата в функционировании фермента. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи: 1. Выяснить механизм воздействия различных ПАВ (анионных, катионных и с разными полярными группами) на активность фосфолипазы D из белокачанной капусты в присутствии фосфатидилхолина (ФХ) как субстрата реакции, изменение ее структуры и связывание ПАВ, используя различные физико-химические методы (светорассеяние, УФ-спектроскопию и потенциометрию с ионоселективным электродом на ПАВ). 2. Исследовать функциональную активность фосфолипазы D в водных растворах с ФХ, находящимся в виде мицелл и везикул, для выяснения зависимости функционирования фермента от агрегатного состояния субстрата. 3. Установить характер воздействия гидрофобно модифицированных полисахаридов, являющихся полимерным аналогом ПАВ, на активность и структуру фосфолипазы D с помощью различных физико-химические методов (светорассеяния, УФ-спектроскопии и динамической реологии) и провести их сопоставление с низкомолекулярными ПАВ. Научная новизна работы. Впервые систематически исследовано влияние ПАВ на гидролитическую активность растительной фосфолипазы D, что позволило предложить механизм их регулирующего воздействия на 7 функционирование фермента, в котором белковая макромолекула приобретает оптимальную структуру в результате ее конформационных перестроек под воздействием введенных веществ. Установлена схожесть в воздействии ПАВ и изменения рН среды на третичную структуру и активность фосфолипазы D. Впервые установлено, что полисахариды оказывают заметный эффект на функционирование фосфолипазы D. Показано, что в отличие от низкомолекулярных ПАВ анионный полисахарид оказывал ингибирующий эффект, тогда как катионные полисахариды и ПАВ взаимодействовали с фосфолипазой D различным образом. Обнаружено, что воздействие гидрофобно модифицированных полисахаридов на функционирование фермента определяется местом нахождения углеводородных радикалов в макромолекуле, которые присоединяются либо к заряженным функциональным группам, либо к основной цепи, располагаясь независимо от этих групп. Рассмотрен возможный механизм влияния полисахаридов на третичную структуру и активность фосфолипазы D. Практическая значимость работы. Предложенный в диссертации механизм воздействия ПАВ на фосфолипазу D позволяет подбирать оптимальные условия для функционирования фермента и прогнозировать его поведение в реакционных средах. Установление характера зависимости гидролитической активности фосфолипазы D от агрегатного состояния субстрата и рН среды может быть использовано для оптимизации ферментативных процессов в биотехнологии. Повышение активности фермента в присутствии катионных полисахаридов, включая гидрофобно модифицированные, позволяет предложить их в качестве альтернативы ПАВ, поскольку при использовании полимеров упрощается очистка продуктов реакции. На защиту выносятся: - влияние различных ПАВ на гидролитическую активность фосфолипазы D, - регулирование активности фосфолипазы D изменением агрегатного состояния субстрата и рН среды, - механизм воздействия ПАВ на активность фермента, - воздействие анионного, катионного и гидрофобно модифицированных полисахаридов на гидролитическую активность фосфолипазы D. Апробация работы. Основные положения были представлены и доложены на региональной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы морской биологии и экологии" (Владивосток, 1998); 12th Conference of the European Colloid and Interface Society, Dubrovnik-Covtat, Croatia, 1998. Fist International symposium "Self-Assembly of Amphiphilic Systems", Dresden, 1998. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах. Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждения, заключение, выводы и список литературы, содержащий 152 ссылки. Работа изложена на 110 страницах, содержит 7 таблиц, 27 рисунков. Благодарности. Выражаю искрению благодарность своим научным руководителям д.х.н. Ю.А. Щипунову, к.х.н. Шумилиной Е.В. и д.б.н. Э.Я. Костецкому за огромную и неоценимую помощь на всех этапах выполнения работы, а также анализа полученных результатов. 9 Глава 1. Литературный обзор 1.1. Амфифилы, их классификация и основные физико-химические свойства Амфифилами называют обширную группу веществ, которая включает самые разнообразные классы соединений. К ним относят липиды, фосфолипиды и синтетические ПАВ. Их характерной особенностью является наличие гидрофобной (неполярной) и гидрофильной (полярной) групп (Helenius, Simons, 1975, Jonsson etal, 1998). Гидрофобная группа в молекуле амфифилов обычно представлена алифатическим, ароматическим или полициклическим остатком. Чаще всего амфифилы содержат углеводородные цепи, число которых может варьировать от одной до четырех. Они могут быть как разветвленного, так и линейного строения, а их длина варьирует от 8 до 18 углеродных атомов. Гидрофобная группа растворима во многих неполярных растворителях и практически нерастворима в воде. Гидрофильная группа в молекуле амфифилов может быть представлена аминогруппой, фосфатной, сульфатной, карбоксильной, гидроксильной или карбонильной группами. Она соединена с одним из концов углеводородной цепи неполярной группы. Длина цепи, степень разветвленности гидрофобной группы, место присоединения гидрофильной группы являются факторами, определяющими самоорганизацию амфифилов в растворе и их физико-химические свойства (Jonsson et al, 1998). Другим важным фактором, влияющим на физико-химические свойства амфифилов, является заряд полярной группы. В зависимости от его наличия различают заряженные, незаряженные и цвиттер-ионные амфифилы (Dennis, 1986). К числу заряженных амфифилов относятся катионные и анионные соединения. Молекулы цвиттер-ионов содержат как положительно, так и отрицательно заряженные функциональные группы. За счет взаимной компенсации суммарный заряд молекулы равняется нулю. Если функциональные группы представлены аминогруппой и карбоксильной, то 10 заряд молекулы зависит от рН среды, в следствии того, что диссоциация -NH2 и -СООН групп определяет рН раствора. Такие амфифилы в кислой или щелочной областях приобретают положительный или отрицательный заряд, соответственно, что позволяет отнести их к числу катионных или анионных ПАВ (Small, 1986). Цвиттер-ионными они являются только в нейтральных средах. Системы, включающие амфифил и растворитель, разделяются на гомогенные и гетерогенные. Гетерогенные системы содержат несколько фаз, тогда как гомогенные системы представлены твердым телом (кристаллом), жидкокристаллической фазой, истинным, либо мицеллярным изотропным растворами. Кристаллы характеризуются трехмерным порядком в расположении молекул. Жидкие кристаллы по степени молекулярной упорядоченности занимают промежуточное положение между твердыми телами и жидкостями. Они текут и одновременно имеют оптические свойства характерные для кристаллов. К числу жидкокристаллических структур относятся кубическая, гексагональная и ламеллярная мезофазы (Jonsson etal, 1998). Мицеллярный изотропный раствор, в отличие от истинного раствора, содержит в своем объеме агрегаты трех типов: сферические, стержнеобразные или цилиндрические мицеллы (Jonsson etal., 1998). Амфифилы подразделяются на две большие группы это синтетические ПАВ и липиды, включающие ФЛ. Характеристика и физико-химические свойства ПАВ и ФЛ будут рассмотрены более подробно в последующих главах. 1.1.1. Характеристика синтетических поверхностно-активных веществ Синтетическими ПАВ называются соединения, проявляющие активность по отношению к границе раздела фаз. В результате их адсорбции 11 на поверхности водных растворов происходит уменьшение поверхностного (межфазного) натяжения (Jonsson etal, 1998). Подавляющее большинство используемых ПАВ получено в результате органического синтеза. К числу основных синтетических ПАВ, широко использованных в различных областях, относятся соли жирных кислот, алкилсульфаты, алкилсульфонаты и алкиламины. ПАВ могут быть ионогенные, диссоциирующие в водных растворах на ионы, и неионогенные, которые такой способностью не обладают. Примером первых служит додецилсульфат натрия (ДДС). Его структурная формула представлена в табл. 1.1. Он относится к числу анионных ПАВ, поскольку диссоциирует в воде с образованием поверхностно-активного аниона. В результате диссоциации катионных ПАВ, например цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) (табл. 1.1), в растворе присутствует поверхностно-активный катион. К числу неионогенных ПАВ можно отнести пара-трет-октипдренип полиоксиэтиленовый эфир (Тритон Х-100) (табл. 1.1). Имеется еще достаточно обширная группа ПАВ, входящих в группу цвиттерионов. Как отмечалось выше, они содержат в своем составе как положительно, так и отрицательно заряженные функциональные группы (Helenius et ah, 1979). В силу своей амфифильной природы молекулы ПАВ в объеме раствора склонны к объединению друг с другом и формированию агрегатов, называемых мицеллами. Молекулы ПАВ находятся в мономерном состоянии только в разбавленных растворах. Повышение их концентрации приводит к появлению агрегатов. Число молекул, из которых они состоят, называется «числом агрегации» N. Значения N варьируют в достаточно широких пределах. Они зависят от структуры вещества, заряда полярной области, длины углеводородной цепи, а также условий эксперимента. Если агрегаты образованы молекулами ПАВ, число которых N < 10, то следует говорить о формировании ассоциатов (Паничева, Маркина, 1981; Маркина и др., 1989). Если же N> 10, то говорят о мицеллообразовании (Reynolds et ah, 1977). Таблица 1.1 Типы ПАВ, их структурные формулы, числа агрегации (N), ККМ и методы определения ККМ в водных растворах Химическое название Структурная формула N ККМ при 25°С (M/l*ltf) значения метод определения, источник 1. Анионные ПАВ 62 8,185 8,27 8,15 по удельной электрической проводимости, светорассеяние по Дебаю по поверхностному натяжению (Абрамзон и др., 1979) ДЦС CH3(CH2)nOSCy-Na+ Холат натрия он i^S^AtoO'Na' 2-4 13-15 по удельной электрической проводимости (Абрамзон и др., 1979) Олеат натрия C18H33O2Na 2,1 по удельной электрической проводимости (Абрамзон и др., 1979) 2. Катионные ПАВ 169 0,8 0,98 по поверхностному натяжению по удельной электрической проводимости (Абрамзон и др., 1979) ЦТАБ CH3(CH2)15N+(CH3)3Br Додециламмония хлорид CH3(CH2)nN+H3Cr 55 0,15 по удельной электрической проводимости (Абрамзон и др., 1979) 3. Нейтральные 140 0,1-0,001 по поверхностному натяжению (Абрамзон и др., 1979) пара-трет-ок1Ш§ешт полиоксиэтиловый эфир (Тритон Х-100) (СНз)зСН2С(СНз)2-/~\-О(СН2СН20)пН n = 9-10 12 13 Ассоциация ПАВ обычно наблюдается при достижении определенной концентрации, получившей название критической концентрации мицеллообразования (ККМ). ККМ является физико-химической характеристикой ПАВ, указывающей на их способность к агрегации. Структурные формулы используемых в настоящей работе ПАВ, а также их числа агрегации, ККМ и методы определения ККМ приведены в табл. 1.1. Там же даны характеристики холата натрия, который является природным ПАВ. Движущей силой агрегации ПАВ в мицеллы является выталкивание неполярных частей молекул из водного раствора в результате проявления гидрофобного эффекта. Поэтому неполярные части (алкильные радикалы) находятся внутри мицелл и не контактируют с водой. Они прикрыты полярными группами ПАВ, которые образуют гидрофильную оболочку, которая предотвращает контакт неполярной части молекул с полярной средой (Shinitzky et ah, 1971, Абрамзон и др., 1979; Абрамзон, 1981). Изменение стандартной энергии Гиббса (AG) при агрегации ПАВ выражают в виде уравнения 1.1: AG = i?71nXKKM, (l.i) где R - газовая постоянная, Т — температура, Хккм ~ критическая концентрация мицеллообразования, выраженная в виде мольной доли. ККМ находится из экспериментальной зависимости свойство — состав раствора. Примером может служить изменение поверхностного натяжения или электрической проводимости растворов в зависимости от концентрации ПАВ. Значение ККМ определяется из перегиба на кривых, поскольку свойства истинных и мицеллярных растворов различаются заметным образом. Мицеллы не являются единственной структурой, формирующейся при объединении молекул ПАВ в растворах. Они могут организовываться в 14 структуры, которые получили название надмолекулярных или супрамолекулярных. При этом может происходить формирование жидкокристаллических структур, что определяется концентрацией вещества, соотношением полярной и неполярной частей в молекуле амфифила, природой противоиона для ионогенных ПАВ, присутствием и типом растворителя, температурой. Подробнее типы и формирование жидкокристаллических структур будут рассмотрены в главе 1.1.3. 1.1.2. Распространение, структура и функция фосфолипидов ФЛ — группа полярных липидов, широко распространенных в живой природе. Они составляют основу липидного матрикса биологических мембран и участвуют в клеточном метаболизме. В их число входят ФХ, фосфатидная кислота (ФК), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилглицерин (ФГ), дифосфатидилглицерин (ДФГ), фосфатидилинозитол (ФИ), сфингомиелин (СМ). Структурные формулы некоторых фосфолипидов даны на рис. 1.1. Содержание ФЛ в живой клетке варьирует в пределах 5-60 мас% (на сухую массу), а в нервных тканях достигает 60-80 мас%. Среди ФЛ у позвоночных и некоторых беспозвоночных на первом месте по содержанию в мембранах находится ФХ. Его количество составляет 40-50% от содержания всех ФЛ (Некое, Берестовский, 1982; Gunstone et ah, 1994). Основными природными источниками ФЛ для промышленного производства являются соя и желток куриных яиц. Молекулы ФЛ построены на основе глицерина или аминоспирта сфинганина, чаще - 4-сфингенина. На рис. 1.1. показана структурная формула глицерофосфолипидов. В большинстве случаев две гидроксильные группы молекулы глицерина в положении sn-1 и sn-2 этерифицированы жирными кислотами, а третья - фосфорной кислотой. К последней, кроме того, присоединен спиртовой остаток. Они показаны на рис. 1.1. 15 сн3(сн2)14~ с-о-сн2 2 о О X н2с-о-р-о 6" / - СН2СН21чГ(СНз)з - Фосфатидилхолин - Н - Фосфатидная кислота - Фосфатидилэтаноламин j - ^ri2^i-i^iN n3^uv - Фосфатидилсерин - Фосфатидилинозитол - CH2CH(N+H3)COO- он Ч. - СН2СН(ОН)СН2ОН - Фосфатидилглицерин Рис. 1.1. Структурная формула глицерофосфолипидов (1-пальмитоил-2-олеил-5«-глицеро-3-фосфатидов), в которой X обозначает различные полярные группы. Полное название ФЛ получают сочетанием названий неполярной области и полярных групп. Например, 1-пальмитоил-2-олеил-5«-глицеро-3-фосфатидилхолин. Аббревиатура sn обозначает стереоспецифическую нумерацию, указывающую на оптическую активность молекул ФЛ. Особенностью ФЛ является то, что они содержат не одну полярную группу, как большинство синтетических ПАВ, а остатки трех полярных веществ. ФЛ включают остаток глицерина, фосфатидной кислоты и, например, холина. Поэтому полярная область получается достаточно объемной. Кроме того, большинство ФЛ, как видно из рис. 1.1. относятся к цвиттерионным амфифилам. Например, в молекуле ФХ присутствует отрицательно заряженная фосфатидная группа и положительно заряженный холин. Обе группы остаются в заряженном состоянии в диапазоне рН от 2 до 14, поскольку для ФХ рК четвертичного амина равен 13,9, а фосфатной 16 группы -2,1. ФЭ - является цвиттерионом в более узком диапазоне рН (2,1-10), поскольку рК аминогруппы равен 10,6 (Некое, Берестовский, 1981). 1.1.3. Агрегатное состояние фосфолипидов в водном растворе ФЛ в воде не растворяются, но при контакте с ней гидратируются и набухают. В зависимости от степени набухания (количества включенной воды) ФЛ формируют разные жидкокристаллические структуры (мезофазы), т.е. проявляют лиотропный мезоморфизм (Bergenstahl, Fontell, 1983). Это будет рассмотрено на примере ФХ. Данный ФЛ наиболее подробно изучался многими авторами, а кроме того, он используется в настоящей работе. Тип структуры, формируемой при самоорганизации ФХ в водной среде, зависит от длины углеводородных радикалов. Короткоцепочечные синтетические ФХ, содержащие остатки жирных кислот с углеводородной цепью с шестью или восьмью углеводородными атомами, агрегируют в воде с образованием мицелл. В зависимости от размера гидрофобной части амфифила формируются агрегаты различной формы: если вещество содержит С6/С6 радикалы, то мицеллы получаются сферические, если С7/С7 или Cs/Cg радикалы - то стержнеподобные (Saunders, 1966; Tausk et al, 1974). ФХ, содержащие остатки жирных кислот с углеводородной цепью с девятью и более углеводородными атомами, предпочтительно самоорганизуются в жидкокристаллические структуры (Tausk et al, 1974). На рис. 1.2 дана бинарная фазовая диаграмма для яичного ФХ. Для яичного ФХ, как и для большинства ФХ, преобладающей является ламеллярная мезофаза. Она образована множеством параллельно расположенных ламелл, которые представляют собой бимолекулярный слой. Полярные группы молекул ФЛ находятся на поверхности бислоев, а углеводородные цепи заполняют внутренний объем. Вода формирует гидратную оболочку полярных групп и водную прослойку между ламеллами. 17 Гексагональная Двухфазная система (изотропные жидкости) Двухфазная система (две изотропные жидкости) La + Up Область формирования везикул 50 Сеоды.мас.% Рис. 1.2. Фазовая диаграмма и схематическое изображение формируемых структур для яичного ФХ (Shchipunov, 2002). Как видно из диаграммы 1.2, гомогенная ламеллярная мезофазы La является преобладающей. Она формируется в широком диапазоне как концентраций, так и температур. При комнатной температуре гомогенная ламеллярная мезофаза La существует, если содержание воды варьирует от 9-10 до 43-45 мас.%. При содержании воды >45%, ламеллярная мезофаза La расслаивается на мезофазу La и водный раствор (Za+H2O). Это область формирования липосом и везикул. При небольшом содержании воды (<10 мас.%) наблюдается образование других жидкокристаллических мезофаз: ламеллярной Lp, гексагональной Нц и кубической Q. В области низких температур существуют ламеллярные мезофазы La и Lp. С ростом температуры происходит переход к небислойным мезофазам - гексагональной Нц и кубической Q. Фазовый переход вызывается различным расширением полярных и неполярных областей бислоя при нагревании. В большей степени он расширяется в области углеводородных цепей ФХ, за счет термической активации cis-trans-nQpexoROB C-C связей (Luzzati, 1968; Miller et ah, 1999).

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	24760.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

03.11.24 Лексикографический анализ единиц поля

03.11.24 Из истории слова гость и его производных

03.11.24 Семантическое поле гость в русском языке

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2024. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.