У нас уже 21989 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Молекулярная детекция представителей зипертермофильнык аркей и характеристика аркейной термостаБильной ДНК-полимеразы
Количество страниц 97
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 23014.doc 
Содержание Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1. Гипертермофильные микроорганизмы 7

1.1. Места обитания гипертермофилов 8

1.2. Физиологические свойства гипертермофилов 10

1.3. Филогения и таксономия гипертермофилов 12

2. Род Thermococcus 14

2.1. Таксономия и места обитания 14

2.2. Генотипическое разнообразие 20

2.3. Фенотипические свойства 21

3. Возможности промышленного использования ферментов гипертермофилов 26 3.1 Термостабильные ДНК-полимеразы 28

4. Молекулярные методы в микробной экологии 30

4.1. Роль молекулы 16S рРНК в современной таксономии и филогении 30

4.2. ПЦР-клонирование-секвенирование - основная магистраль молекулярного анализа микробных сообществ 32

4.2.1. ПЦР со специфичными праймерами 33

4.3. Электрофорез в денатурирующем градиентном геле 34

4.4. In situ гибридизация 34

4.5. Недостатки методов микробной молекулярной экологии 35 4.6 Сочетание методов классической и молекулярной микробной экологии 37

РЕЗЮМЕ 38

И. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 52

1. ПЦР-детекция гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae 52 1.1 .Специфичность праймеров ТсРс 173F-TcPc589R 52

1.2. Чувствительность метода 57

1.3. Идентификация чистых культур микроорганизмов 59

1.4. Детекция представителей Thermococcaceae в природных образцах и накопительных культурах 61

2. ПЦР-детекция архей в гипертермофильной накопительной культуре, полученной из метантенка, работающего в термофильном режиме 65

2.1. Получение культуры гипертермофильных микроорганизмов 66

2.2. ПЦР-анализ накопительных культур 66

2.3. Амплификация и сиквснс архейных генов 16S рРНК 69

2.4. Физиологические характеристики роста КР4 70

3. Выделение и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы 72

3.1. Скрининг коллекции гипертермофильных архей на наличие термостабильных ДНК-полимераз 72

3.2. In situ характеристика отобранных архейных термостабильных полимераз 74

3.3. Выделение и очистка ДНК-полимеразы из штамма

Thermococcus sp Shi AM 76

3.4. Молекулярная масса и термостабильность очищенной ДНК-полимеразы 76

3.5. Способность к ПЦР-амплификации ДНК 76

3.6. Характеристика 3'-5'экзонуклеазной активности 80

3.7. Определение частоты ошибок выделенной ДНК-полимеразы 80

4. Клонирование гена ДНК-полимеразы из штамма Thermococcus sp. Shi AM 84

5. Экспрессия гена ДНК-полимеразы из Thermococcus sp. Shi AM 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94 ВЫВОДЫ 96 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 97

ВВЕДЕНИЕ

Гипертермофильными называют микроорганизмы с оптимумом роста при температурах выше 80°С (Stetter, 1996a). В отличие от обычных термофилов, они, как правило, не растут при температурах ниже 60°С. За последние 30 лет интерес к гипертермофильным микроорганизмам в научном сообществе постоянно растет. Современные гидротермальные системы можно рассматривать как аналог древних биоценозов Земли. Таким образом, изучение термофильных прокариот является важным как для понимания эволюции микроорганизмов и их метаболических путей, так и для понимания эволюции биосферы в целом. В термальных экосистемах гипертермофильные микроорганизмы могут выполнять функции первичных продуцентов и/или деструкторов органического вещества (Huber et al., 2000). Гипотеза о существовании горячей подземной биосферы, с суммарным количеством биомассы, превосходящим наземную (Gold, 1992), предполагает активное участие термофильных микроорганизмов в современных биогеохимических процессах. Кроме того, исключительная устойчивость их биополимеров к высоким температурам делает их перспективными объектами, как для фундаментальных исследований, так и в связи с возможностью применения в различных областях биотехнологии (Vielle and Zeikus, 2001). Подавляющее большинство гипертермофильных организмов составляют археи (Stetter, 1996a). Предметом рассмотрения данной работы являются гипертермофильные археи, в основном относящиеся к семейству Thermococcaceae и роду Thermococcus.

Род Thermococcus входит в порядок Thermococcales царства Euryarchaeota. Род представляет собой филогенетически обособленную и самую многочисленную группу гипертермофильных архей, причем количество описанных видов составляет, очевидно, лишь небольшую часть обитающих в природе. В связи с этим дальнейшие поиски новых штаммов могут проходить как экстенсивно - путем исследования новых экосистем по всему миру, так и интенсивно - за счет выделения новых видов из уже известных местообитаний. Генетическое разнообразие термококков значительно шире, чем это можно было бы предположить на основе их высоко консервативного гена 16S рРНК. Это разнообразие дает основания ожидать у представителей этого рода наличия новых, пока неизвестных физиологических и метаболических свойств. Кроме того, с биотехнологической точки зрения это одна из самых перспективных групп микроорганизмов.

Биотехнологический потенциал гипертермофильных архей в большой степени связан с наличием у них термостабильных ферментов, среди которых наиболее широко используемыми и коммерчески успешными являются термостабильные ДНК-полимеразы. Основным преимуществом ДНК-полимераз архей перед термостабильными бактериальными полимеразами можно считать более высокую термостабильность и точность копирования. Все коммерчески используемые архейные ДНК-полимеразы получены из представителей семейства Thermococcaceae.

В последние два десятилетия в микробной экологии широко используются методы молекулярной биологии. Главное преимущество и причина широкого использования молекулярных методов, основанных на анализе нуклеотидных последовательностей 16S рРНК, заключается в возможности изучения филогенетического состава микробного сообщества без предварительных стадий культивирования. Ключевым этапом практически всех молекулярно-экологических исследований является амплификация участков генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Постоянное увеличение числа сиквенсов рРНК в базах данных приводит к необходимости создания все новых праймеров, причем к специфичности праймеров, используемых для детекции и идентификации определенного организма в окружающей среде, предъявляют более высокие требования.

В связи с вышеизложенным, детекция гипертермофильных архей в различных экосистемах представляет научный и практический интерес. Наиболее перспективным способом решения этой задачи представляется сочетание традиционных методов культивирования с современными молекулярно-экологическими методами.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась молекулярная детекция гипертермофильных архей с помощью олигонуклсотидных праймеров, специфичных к генам 16S рРНК, а также оценка биотехнологического потенциала

коллекции гипертермофильных архей.

Для достижения этой цели следовало решить следующие задачи.

1. Разработать метод молекулярной детекции микроорганизмов семейства Thermococcaceae и провести идентификацию новых гипертермофильных изолятов.

2. Провести ПЦР-детекцию архей в гипертермофильных накопительных культурах и образцах из природных и антропогенных местообитаний.

3. Провести скрининг коллекции термофильных архей лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН на наличие термостабильных ДНК-полимераз.

4. В случае обнаружения термостабильной ДНК-полимеразы детально исследовать ее свойства с точки зрения возможного применения в биотехнологии. ( Научная новизна работы. Впервые разработаны и синтезированы

высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры для ПЦР-детекции гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae. Доказанная высокая специфичность праймеров позволяет делать выводы о наличии представителей семейства Thermococcaceae в накопительных культурах и природных образцах непосредственно по результатам амплификации.

Впервые в системе анаэробной биологической очистки культуральными и молекулярно-экологическими методами обнаружены гипертермофильные архей. В антропогенном местообитании с нейтральным значением рН обнаружен культивируемый представитель царства Crenarchaeota. Результаты исследования расширяют представление о составе микробных сообществ, участвующих в процессе анаэробного разложения органических веществ в системах биологической очистки сточных вод и увеличивают список мест обитания филогенетической группы Crenarchaeota, а также физиологической группы гипертермофильных микроорганизмов.

По результатам скрининга коллекции термофильных архей определен штамм, обладающий ДНК-полимеразой с наиболее перспективными свойствами. Из штамма Thermococcus sp. Shi AM выделена и очищена термостабильная ДНК-полимераза, не содержащая интеинов. Показано, что выделенная ДНК-полимераза обладает такими важными с биотехнологической точки зрения свойствами как высокая термостабильность и точность копирования. Выделен и клонирован ген архейной ДНК-полимеразы и получен штамм-продуцент рекомбинантного белка.

Практическая значимость работы. Предложен простой, быстрый, надежный и чувствительный метод обнаружения гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae, основанный на ПЦР-амплификации генов 16S рРНК с помощью высокоспецифичных олигопуклеотидных праймеров.

Выделена и очищена новая архейная термостабильная ДНК-полимераза. Ген, кодирующий эту полимеразу, клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli. Полученный фермент может найти широкое применение в молекулярной биологии, генетике, молекулярной диагностике.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конгрессах "Extremophiles'2002" H"Extremophiles'2000", а также на международной конференции "Workshop on Enzymology, Molecular biology and Biochemistry of Thermophiles", 2000.

Автор выражает искреннюю признательность к.б.н. Черных Н.А., к.б.н. Лебединскому А.В., к.б.н. Мирошниченко М.Л., к.б.н. Кострикиной Н.А., к.б.н. Туровой Т.П. за помощь на определенных этапах работы. Часть работы, связанная с выделением и клонированием ДНК-полимеразы, проводилась совместно с центром "Биоинженерия" РАН, сотрудникам которого автор выражает свою благодарность, особенно к.б.н. Лопатину С.А. и к.б.н. Эльдарову М.А., практически осуществлявшему научное руководство этой частью работы.

Особую благодарность автор выражает научному руководителю д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за предложенную тему, обсуждение результатов, ценные советы и замечания и общее научное руководство, а также к.б.н. Слободкину А.И. за постоянное внимание и помощь в работе и при подготовке рукописи диссертации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Slobodkin A.I., Subbotina I.V., Bonch-Osmolovskaya Е.А. Lebedinsky A.V. 2004. PCR-based identification of hyperthermophilic Archaea of the family Thermococcaceae. Appl. Environ. Microbiol. 70:5701-5703.

2. Слободкина Г.Б., Слободкин А.И., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Бонч-Осмоловская Е.А. 2004. Обнаружение культивируемой гипертермофильной археи рода Sulfophobococcus в метантенке, работающем в термофильном режиме. Микробиология. 73:716-720.

3. Г.Б. Слободкина, Н.А. Черных, С.А. Лопатин, Г.Е. Ильина, А.В. Банникова, В. Анкенбауэр, М.А. Эльдаров, В.П. Варламов, Е.А. Бонч-Осмоловская. 2005. Выделение и характеристика термостабильной ДНК-полимеразы гипертермофильной археи Thermococcus litoralis Shi AM. Прикладная биохимия и микробиология. 1:40-47.

4. Lebedinsky A.V., Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Schleper CM. 2000. Nested PCR as a method for monitoring Crenarchaeota in mixed cultutes. Abstr. Int. Workshop on Enzymology, Molecular biology and Biochemistry of

Thermophiles. 6-12 August 2000, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Book of Abstr., p 27.

5. Lcbedinsky A.V., Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Schleper CM. 2000. Obtaining of a mixed culture containing psychrotrophic Crenarchaeota using nested PCR as a method for monitoring. Abstr. 3th Int. Congress on Extremophiles'2000. 3-7 September, Hamburg, Germany. Book of Abstr. P27, p.95

6. Slobodkina G.B., Subbotina I.V., Lebedinsky A.V., Slobodkin A.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., Chernyh N.A. 2002. PCR-based detection and identification of hyperthermophilic Archaea of the family Thermococcaceae. Abstr. 4th Int. Congress on Extremophiles'2002. 22-26 September, 2002, Naples, Italy. Book of Abstr. P47, p. 181.

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 23014.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2024. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.